1.将 Keratinocyte细胞种于96 孔板中，每组设5个复孔，每孔100 μl细胞悬液。当细胞达到80%的融合度时， 取出预培养的细胞，除去培养基，用PBS洗涤细胞 3 次。如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo 4/AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。 2.加入100 μl含1 µmol/l fluo4/AM于 96 孔板中，并在 37 ℃， 5% CO2 的培养箱中 温育30 min，移去荧光探针后，接着采用200 μl PBS再于37℃， 5% CO2 的培养箱中温育 20 min。 3.空白组加入100μl KC2500培养基，NC组加入不同浓度的CAP,于37℃， 5% CO2 的培养箱中温育 30 min。除去培养基，用PBS洗涤细胞 3 次。 4.避光条件下于荧光酶标仪上进行检测，激发波长为 485 nm，发射波长为520 nm，记录吸光度值。 分组 检测模型 处理条件 探针浓度 刺激条件 检测指标 检测方法 BC KC 培养基 1uM —— Ca2+浓度 荧光酶标仪 NC 40nM(培养基) 1uM (CAP) 800nM(培养基) 1uM 8uM(培养基) 1uM 16uM(培养基) 1uM 32uM(培养基) 1uM 备注：以上实验目的是筛选得到荧光值最大的CAP浓度，并展开一下实验操作。 1.将 Keratinocyte细胞种于96 孔板中，每组设5个复孔，每孔100 μl细胞悬液。当细胞达到80%的融合度时， 取出预培养的细胞，除去培养基，用PBS洗涤细胞 3 次。 PC组、sample组分别加入对应的样品溶液，每孔100 μl；对照组和 CAP 组分别加入相应的溶剂，每孔100 μl，混匀，置37℃二氧化碳培养箱中避光孵育30 min。用PBS洗涤细胞 3 次。 2.各实验组，每孔加入100 μl预先配置好的 Fluo-4AM（1μmol/L）溶液，37℃二氧化碳培养箱中避光孵育细胞。30 min 后，取出细胞，PBS缓冲液 洗涤 2 遍。移去荧光探针后，接着采用200 μl PBS再于37℃， 5% CO2 的培养箱中温育 20 min。 3.NC组、PC组和 sample组分别加入终浓度为？？？的 CAP 溶液，混匀。于37℃， 5% CO2 的培养箱中温育 30 min。除去培养基，用PBS洗涤细胞 3 次。 4.避光条件下于荧光酶标仪上进行检测，激发波长为 485 nm，发射波 长为520 nm，记录吸光度值。 样品/分组 检测模型 处理条件 刺激条件 检测指标 检测方法 BC Keratinocytes 培养基 —— Ca2+浓度 荧光酶标仪 NC CAP(培养基) 筛出CAPmax浓度 PC 7.8μg/ml（反4） Sample1 —— Sample2 —— Sample3 —— Sample4 —— Sample5 ——